题目: 免疫后小鼠肺部空间转录组与单细胞转录组和单细胞表观基因组的整合分析
DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.104900 (opens new window)
Cite:Xu Z, Wang X, Fan L, Wang F, Lin B, Wang J, Trevejo-Nuñez G, Chen W, Chen K. Integrative analysis of spatial transcriptome with single-cell transcriptome and single-cell epigenome in mouse lungs after immunization. iScience. 2022 Aug 9;25(9):104900.
Pubmed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9418911/ (opens new window)

作者介绍：

Kong Chen
Department of Medicine, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA
kong.chen2@chp.edu

Abstract:

了解肺免疫需要对肺内精确解剖位置的组织驻留 T 细胞进行无偏分析，但此类信息尚未在免疫小鼠模型中得到表征。在这项初步研究中，我们使用 10x Genomics Chromium 和 Visium 平台，对使用成熟的肺炎克雷伯菌免疫后的小鼠肺细胞进行了空间转录组与单细胞 RNA-seq 和单细胞 ATAC-seq 的综合分析感染模型。我们建立了一个优化的反卷积管道，可以通过解剖位置准确解读特定的细胞类型组成。我们发现，结合 scATAC-seq 和 scRNA-seq 数据可以提供更可靠的细胞类型识别，特别是对于谱系特异性 T 辅助细胞。结合所有三种方式，我们观察到 T 辅助细胞及其相应趋化因子的位置的动态变化。总之，我们的原理验证研究证明了单细胞多组学分析在揭示肺免疫的空间和细胞类型依赖性机制方面的力量和潜力。

Highlights:

• 利用ST验证了反卷积工作流程来研究肺免疫
• 通过整合scRNA-seq和scATAC-seq数据鉴定了15种肺细胞类型
• 肺炎克雷伯菌再次攻击后，发现 Th17 细胞比 Th1 更靠近气道
• 肺炎克雷伯菌再次攻击后，气道中大量免疫反应被激活

Introduction:

免疫记忆由B细胞和T细胞记忆组成，是遭遇病原体入侵后获得性免疫的关键特征。组织驻留记忆 T 细胞最近被定义为一个新的亚群，主要存在于粘膜组织、屏障表面和其他非淋巴器官中，但也存在于淋巴部位。过去已经对这些 T 细胞的组织定位进行了彻底的研究，并且使用成熟的流式细胞术和转录组学方法对小鼠和人类之间的比较进行了广泛的表征。然而，使用传统的流式细胞术、转录组学方法，甚至最新开发的单一方法，还无法对肺内不同解剖位置（例如气道与实质）的组织驻留免疫细胞进行无偏倚、高通量的基因表达谱分析。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）已逐渐应用于研究小鼠肺部的免疫细胞和免疫反应。最近很少有研究利用单细胞 ATAC-seq (scATAC-seq) 来测量小鼠肺部免疫细胞的染色质结构。尽管这些技术为理解细胞异质性和小鼠肺部的生物信息提供了丰富的信息，但在此过程中单个细胞的空间信息丢失了。空间转录组学 (ST) 是一项最近开发的技术，能够将转录特征映射到不同的解剖区域。迄今为止，它很少用于了解肺组织，并且经常对没有免疫干扰（例如疫苗接种和重新攻击）的原始肺进行计时。在这项一流的研究中，我们采用了市售的 ST 平台来研究免疫和再次攻击后小鼠肺部基因表达的空间拓扑。为了克服当前ST技术的分辨率限制，我们还应用最先进的单细胞转录组学和单细胞表观基因组学来共同研究这种免疫/再攻击诱导的 T 细胞的空间定位、转录组和表观基因组。三种组学数据的综合分析提供了一种前所未有的全面方法来检查基因组规模上肺部免疫的动态，这对于假设生成和假设检验实验的设计非常有价值。

Results:

Figure 1: Generation of multi-omics datasets of mice lungs after immunization.

Figure 1. 免疫后小鼠肺部多组学数据集的生成

(A) 研究设计概述。scRNA-seq 数据充当连接 scATAC-seq 和空间转录组数据的桥梁。
(B) scRNA-seq 数据中识别的 12 种肺细胞类型的 UMAP 图，并根据规范标记进行手动注释。。
(C) 点图显示每种细胞类型的选定典型标记。
(D) 热图显示每种细胞类型的前三个（通过log2倍变化）标记。

Figure 2: Validation of the robustness of deconvolution method for spatial transcriptomics.

Figure 2. 验证空间转录组学反卷积方法的鲁棒性

(A) 与Scgb1a1表达和组织学气道共定位的club cells的比例。(1) A3 切片的组织学显示气道的位置。(2) A3 切片中club cells的比例，使用内部 scRNA-seq 数据进行解卷积。(3) Scgb1a1（club cells的典型标记）在 A3 切片中的表达。
(B) 使用两个独立的 scRNA-seq 参考解卷积的 T 细胞比例非常相似。(1) Cohen 等人的公开 scRNA-seq 数据 (GEO: GSE119228 ) 中鉴定的 20 种肺细胞类型的 UMAP 图。(2) A3 切片中 T 细胞的比例，使用内部 scRNA-seq 数据进行解卷积。(3) A3 切片中 T 细胞的比例，使用 Cohen 等人的公开 scRNA-seq 数据进行解卷积。
(C) (i–iv) 相关热图可视化使用内部（行中，12 种类型）和公共（列中，20 种类型）scRNA-seq 数据解卷积的细胞类型比例，在切片 A1-A4 中高度相关。Pearson 的 r 值由颜色条表示。带有实线的红色框突出显示了选定的适应性免疫细胞、T 细胞和 B 细胞。带虚线的红色框突出显示了选定的先天免疫细胞、中性粒细胞和 NK 细胞。

Figure 3: Identification of subtypes of T cells by integrating scRNA-seq and scATAC-seq data.

Figure 3. 通过整合 scRNA-seq 和 scATAC-seq 数据鉴定 T 细胞亚型

(A) 通过标签转移识别的 scATAC-seq 数据中 12 种肺细胞类型的 UMAP 图。
(B) 条形图显示 scRNA-seq 和 scATAC-seq 数据中 12 种细胞类型的比例非常相似。
(C) scATAC-seq 数据中四种 T 细胞亚型的 UMAP 图。
(D) 热图显示 scATAC-seq 数据中每个 T 细胞亚型的前 10 个 marker 。
(E) (i–iv) Th17 和 Th1 细胞的典型标记Il17a、Rorc、Ifng和Tbx21周围基因组区域的峰值。
(F) 通过标签转移鉴定的 scRNA-seq 数据中四种 T 细胞亚型的 UMAP 图。
(G) 点图显示 scRNA-seq 数据中 Th17 和 Th1 细胞的选定典型 marker 。
(H) scRNA-seq 数据中 15 种肺细胞类型（包括 T 细胞的四种亚型）的 UMAP 图。

Figure 4: Spatial analyses of mice lungs after immunization.

Figure 4. 免疫后小鼠肺部的空间分析

(A) 箱线图显示 4 个切片中 15 种细胞类型的比例不同。
(B) (i-ii) 相关热图可视化免疫小鼠和再次攻击小鼠中 15 种细胞类型的同点共现。
(C) 排除血管内的spot和距气道距离超过 1,000 μm 的spot后，四片中 Th17 和 Th1 细胞到气道的加权距离。
(D) 定义加权距离的公式，考虑到每个点到最近气道的距离以及每个点中 Th17 和 Th1 细胞的比例。
(E) (i-iv) 免疫细胞随气道距离的比例，显示免疫细胞在四个切片中的空间分布，排除血管内的spot和距气道距离超过 1,000 μm 的spot。这些曲线是从自然样条（具有三个自由度）回归获得的。
(F) Ccl20（一种顶部距离相关基因）在四个切片中的表达。
(G) 从肺炎克雷伯菌感染的小鼠肺部采集的上皮细胞 (CD45-CD31-Epcam+) 的 scRNA-seq 数据集中鉴定的 8 种肺细胞类型的 UMAP 图。
(H) UMAP 图显示所选标记的分布。
(I) 小提琴图证明Ccl20在 II 型炎症细胞中升高。

Figure 5: Differential expression analysis of spots annotated as airways in the immunized and the re-challenged mouse.

Figure 5. 免疫小鼠和再次攻击小鼠中注释为气道的斑点的差异表达分析

(A) 气道差异基因分析中所有 16,937 个基因的基因集富集分析 (GSEA)。
(B) AW112010的表达，这是重新攻击后气道中上调的top DE 基因，跨越四个切片。
(C) Cbr2的表达，Cbr2 是重新攻击后在气道中下调的top DE 基因，跨越四个切片。

Figure 6: Cell-cell communication among cell-type enriched spots.

Figure 6. 细胞类型富集点之间的细胞间通讯

(A) 热图显示细胞类型富集点之间的差异相互作用强度。
(B) 条形图显示每个信号通路的总体信息流。
(C) 再次攻击的小鼠中 Th17 富集点是 IL6 信号通路的接收者。(i) 圆形图，可视化重新攻击小鼠中 IL6 信号通路的推断通信网络。免疫小鼠中IL6信号通路网络不显着。圆圈大小代表每组中的斑点数量。边缘颜色与信号发送者（源）一致，边缘权重代表交互强度。(ii) 小提琴图，可视化再次攻击小鼠的细胞类型富集斑点中与 IL6 信号通路相关的基因的表达。切片 A3 的基因表达呈红色，切片 A4 的基因表达呈青色。(iii-iv) Il6和Il6ra周围基因组区域的峰在 scATAC-seq 数据中。
(D) 再次攻击的小鼠中 Th17 富集点是 TGF-β 信号通路的接收者。(i) 圆形图可视化重新攻击小鼠中 TGF-β 信号通路的推断通讯网络。免疫小鼠中的 TGF-β 信号通路网络也很重要，但未显示。圆圈大小代表每组中的斑点数量。边缘颜色与信号发送者（源）一致，边缘权重代表交互强度。(ii) 小提琴图，可视化再次攻击小鼠的细胞类型富集斑点中与 TGF-β 信号通路相关的基因的表达。切片 A3 的基因表达呈红色，切片 A4 的基因表达呈青色。(iii-v) Tgfbr1、Tgfbr2周围基因组区域的峰，以及scATAC-seq 数据中的Acvr1b。